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台式MALDI-8020:N端封闭蛋白序列分析进行时

   2021-09-23 仪品网仪品网1110
核心提示:胰蛋白酶消化,质谱法轻松鉴定蛋白质,已经是非常成熟的工作流程,即便是刚接触MS的用户也能很快掌握。质谱鉴定蛋白的过程中,利用搜索引擎进行蛋白质鉴别,例如 Mascot或Matrix Science进行简单的数据库搜索。

胰蛋白酶消化,质谱法轻松鉴定蛋白质,已经是非常成熟的工作流程,即便是刚接触MS的用户也能很快掌握。质谱鉴定蛋白的过程中,利用搜索引擎进行蛋白质鉴别,例如 Mascot或Matrix Science进行简单的数据库搜索。

然而,有两种情况十分特殊,需要更加昂贵的高端仪器和复杂的工作流程,并且与之相对应的熟练操作员。这两种情况一是数据库中未列出的蛋白质鉴定需求,二是需要进行蛋白质末端序列分析。此外,蛋白质测序仪也通常用作蛋白质末端序列分析的方法,但遇到N端封闭的蛋白质,去封闭是必要的。作为样品序列分析前的预处理,预处理效果取决于蛋白质类型,可能效果不佳,对操作人员有一定要求,需要一定程度的技能和经验,也正是因为这样,在一定程度上限制了它的使用。

近年来,利用MALDI-TOF离子源(ISD:In-Source Decay)中发生的蛋白质碎裂离子,可以分析N末端被封闭或未在数据库中登记的蛋白质序列MS图谱。此外,ISD理论上不受每个样品质量的限制,因此无需胰蛋白酶消化即可直接对高质量蛋白质进行测序。结合电泳胶提取蛋白和岛津台式机MALDI-8020,通过N端封闭蛋白的分子量测定和序列分析的例子,让我们来了解下大蛋白分子直接测序技术MALDI-ISD。

将模型样品N 端被乙酰化的牛碳酸酐酶 (Sigma-Aldrich)溶解在缓冲溶液中进行电泳,95°C下加热5分钟,然后在聚丙烯酰胺凝胶(ATTO12.5 %,预制e-PAGEL)上进行电泳。所得聚丙烯酰胺凝胶用考马斯亮蓝染色以检测蛋白质斑点。使用含有表面活性剂的提取缓冲溶液,我们从凝胶分离的碳酸酐酶的条带中提取蛋白质。使用氯仿/甲醇在提取缓冲溶液中沉淀蛋白质以去除表面活性剂和盐,并使用 MALDI-TOF 质谱仪进行测量。芥子酸用作 MALDI 基质用于蛋白质分子量测量,1,5-二氨基萘 (DAN)用于ISD的序列分析。

接下来,从25 pmol凝胶蛋白条带中提取碳酸酐酶,与基质DAN混合,MALDI-8020线性模式进一步分析。结果如图所示,主要检测到c离子(从蛋白质N段产生的片段)质量一致的峰。通过使用免费软件Mass++ TM和蛋白质氨基酸序列比对工具Basic Local Alignment Search Tool (BLAST),我们对从检测到的峰中获得的氨基酸序列进行了同源性搜索。


实验室测量仪器


鉴定结果显示匹配结果最高的是碳酸酐酶。通过检测到的c离子片段质量和数据库中已有的碳酸酐酶氨基酸序列,我们可以推断出N段序列是SHHWGYGKH...,并且是N-乙酰化的。

MALDI-8020线性模式MALDI-ISD技术,无需复杂的工作流程,无需胰蛋白酶消化即可直接对高质量蛋白质(如本文所述m/z 29030示例)进行N端测序。

该方法在岛津应用专家与美国佛罗里达州立大学、日本爱媛大学高级研究支持中心生物医学分析部、利物浦大学生化与系统生物学系等共同发表的一篇文献中也有应用到。PEPPI-MS基于聚丙烯酰胺凝胶的预分馏,实现质谱法鉴定完整蛋白或蛋白复合物。凝胶分离回收14种人血清蛋白,提取后,用MALDI-8020的MALDI-ISD产生的产物离子鉴定人血清白蛋白N端氨基酸序列。

MALDI-8020是岛津MALDI家族一款体积小巧,性能卓越的特色产品。获得2018年IBO工业设计奖银奖。


MALDI-8020


主要特点:


● 线性台式MALDI-TOF

● 200Hz固态激光器,355nm波长

● 进样速度快

● TrueClean™自动源清洁功能。配有大孔径离子光学系统,可将仪器长时间使用中源的污染风险降至最低。配有基于紫外激光器的源清洁功能,能快速实现自动清洁。

● 静音(<55dB)

● 可视化工作状态




岛津仪器设备

 
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